Gravando potenciais de ação cardíacos no laboratório: o que funciona e onde você vai travar
Se você está chegando no laboratório de fisiologia cardíaca esperando fazer um registro limpo de potencial de ação, a primeira coisa que precisa entender é que o coração não se comporta como um nervo. O potencial de ação dos cardiomiócitos tem uma fase 2 — o platô — que dura centenas de milissegundos, e isso muda completamente a regra do jogo para configuração do amplificador, taxa de amostragem e interpretação do que aparece na tela.
O que é potencial de ação cardiaco e por que ele é diferente do que você já viu
O potencial de ação cardíaco é uma mudança transiente no potencial de membrana que se propaga pelo miocárdio. Ele é dividido classicamente em cinco fases. A fase 0 é a despolarização rápida, mediada pela entrada massiva de sódio através dos canais Nav1.5. A fase 1 é a repolarização precoce, com saída de potássio pelos canais KR. A fase 2, o platô, é onde a maioria dos estudantes se perde: é o balanço entre a entrada de cálcio L-type (Cav1.2) e a saída contínua de potássio. A fase 3 é a repolarização final, dominada pelos canais de retificação tardia. A fase 4 é o potencial de repouso, mantido pelo gradiente de K+ e pela bomba Na+/K+ ATPase. O que diferencia o cardiomiócito ventricular de um neurônio não é só a duração — é a dependência de cálcio para a contração. O platô existe porque o coração precisa que a entrada de cálcio via Cav1.2 gere liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático. Sem essa fase, não há acoplamento excitação-contração funcional. Isso também significa que qualquer fármaco que bloqueie canais de cálcio vai encurtar o platô e, consequentemente, o intervalo QT no ECG.
Configuração prática para registro em preparação isolada
Para gravar potenciais de ação de fibra ventricular de rato ou de cardiomiócito isolado, use um amplificador de potencial de membrana com impedância de entrada superior a 10 Gohms. Eletrodos de microeletrodo de vidro com ponta de 1 a 2 micrômetros e resistência de 40 a 80 Mohms funcionam. A taxa de amostragem mínima deve ser 10 kHz — abaixo disso, a velocidade de elevação da fase 0 (dV/dt máximo) fica distorcida, e você perde informação crítica sobre a função dos canais de sódio. Use solução de Krebs-Henseleit perfundida com 95% O2 e 5% CO2, pH 7.4, temperatura 37°C. A temperatura é o fator mais subestimado. A 37°C o potencial de ação tem duração normal; a 22°C o platô se prolonga artificialmente e a frequência de disparo cai pela metade. Se você estiver comparando dados de diferentes laboratórios, verifique a temperatura antes de qualquer conclusão.
Para estimulação, use eletrodos de platina com gap de 2 mm e pulsos de 2 ms na intensidade de 1,5 a 2 vezes o limiar de captura. Limiar varia entre 5 e 20 microamperes dependendo da espessura do preparado. Acima disso, você gera artefato de estímulo que obstrui a fase 0 nos primeiros 5 milissegundos — e é exatamente nessa janela que você analisa o dV/dt máximo.
O problema que ninguém conta sobre penetração do microeletrodo
A parte mais irritante do registro de potencial de ação intracelular em músculo cardíaco é a penetração. O miocárdio é tecido CONTRACTIL. Mesmo em preparação isolada perfundida, o cardíomiocito continua batendo. Cada contração desloca o célula em relação ao eletrodo, e o potencial de membrana entra em ruído ou perde o contato completamente. Meu workaround: campo de bloqueio cálcio com verapamil a 1 microMolar durante a penetração. Isso suprime a contratilidade sem afetar a morfologia do potencial de ação em si. Após a penetração bem-sucedida e a estabilização do access resistance (geralmente 15 a 30 minutos), posso aumentar gradualmente a concentração ou fazer washout se quiser registrar em condição contrátil. O preço que se paga é que os potenciais de ação em ausência de contração têm fase 4 ligeiramente mais estável, o que pode mascarar alterações de automaticidade em células marcapasso.
Outra variável que causa perda de registro é o access resistance. Se a resistência de acesso subir acima de 20 Mohms durante a penetração, o potencial de membrana medido estará subestimado em até 15 milivolts. Ocorre porque o interior da célula não respondeFast enough às correntes de membrana. A correção por backlash é possível em patch-clamp, mas com microeletrodo simples o único conserto é renovar a penetração com um eletrodo novo.
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Parmetros que você realmente precisa medir — e onde os iniciantes erram
Amplitude do potencial de ação: deve estar entre 100 e 120 mV em ventrículo adulto. Valores abaixo de 90 mV indicam dano celular por penetração ou desnaturação de canais. Duracao do potencial de ação em 50% de repolarizacao (APD50) e em 90% (APD90) sao os padroes. Em ratos wild-type a 37°C, APD90 ventricular fica entre 80 e 120 ms. Em camundongos C57BL/6 pode ser mais curto, 50 a 80 ms, porque a expresão de canais de potássio rapidos (Kv4.2, Kv1.4) e a pompa Na/K sao diferentes entre as especies. O erro mais comum é medir APD no pico do artefato de estimulacao em vez de no inicio da fase 0. O artefato pode durar ate 5 ms, e medirdescuidadamente altera o APD em 3 a 5%. Em estudos de farmacologia, onde se busca diferenciar compostos com efeito marginal, esse erro é suficiente para gerar falso positivo ou falso negativo.
Também não ignore a recuperacao do potencial de acesso apos a penetração. Se o potencial de repouso nao estabilizar em -80 mV ou mais negativo em 5 minutos apos a penetração, a célula está comprometida. Dados de células com potencial de repouso entre -60 e -70 mV tendem a ter fases 0 menos pronunciadas porque parte dos canais de sódio está inativada pelo despolarização basal.
Uso de software livre para analise e modelos computacionais
Para análise dos registros, o MySim2 (disponível gratuitamente no site do consórcio CellML) permite simular potenciais de ação com modelos de Ten Tusscher-Noble-Novelly-Hunter (rat) ou Shannon-Wang (humano). Para processamento de sinais experimentais, o Clampfit da Axon tem funcionalidade adequada, mas se voce quer uma alternativa open source, o Spykee do Laboratório de Biofísica da USP permite importação de dados de microeletrodo e cálculo automatico de APD, dV/dt max e potencial de repouso. Para quem esta começando e quer treinar o reconhecimento de fases sem preparar biológica, o cardiacAP demo do programa OpenCARP baixa diretamente do repositório GitHub do projeto e oferece tracings simulados de celulas ventriculares, nodais e de Purkinje com variacao de concentracoes iônicas e bloqueio farmacológico. É util para aprender a identificar artefatos versus fenomeno biologico antes de se deparar com um preparo real.
Limitacoes reais que voce precisa saber antes de planejar o experimento
Registro intracelular com microeletrodo so funciona em preparacoes grues — tecido com espessura inferior a 200 micrômetros. Se o seu preparado é mais grosso, o oxigênio nao difunde ate o centro e as celulas da camada interna morrem em 20 a 30 minutos. Nao adianta insistir. Use registro optico com corante voltage-sensitive (di-4-ANEPPS ou RH-1691) nesses casos. A resolucao temporal cai para 1 kHz, mas voce obtém sinal de toda a espessura do tejido simultaneamente. O segundo problema é a variabilidade inter-preparo. Dois ventriculos de ratos da mesma linhagem, mesmo peso, registrados no mesmo dia, podem apresentar APD90 com diferenca de 30%. Isso acontece porque a distribuição de canais de potássio nao é uniforme no epimio, mesimio e endomio. Se voceesta testando um composto, precise de pelo menos seis preparados diferentes e analise cada um como unidade estatistica, nao pooling de celulas dentro do mesmo preparo.
O terceiro ponto, e talvez o mais negligenciado: o potencial de ação de celulas nodais (SA e AV) nao segue o padrao ventricular. A fase 0 é mediated por cálcio, nao por sódio. O potencial de repouso é menos negativo — entre -55 e -60 mV. A fase 4 tem despolarização automatica. Se voce aplicar protocolos validados para celulas ventriculares em celulas nodais, vai interpretar mal a farmacologia. Bloqueadores de sódio classe I, por exemplo, tem efeito pratico nulo no nodo sinusal.
Consideracoes finais sobre potencial de ação cardiaco em pratica clinica e experimental
A traducao do que se observa in vitro para o paciente depende de varios fatores que raramente sao mencionados em protocolos. A temperatura in vivo e 37°C; a temperatura de cultivo ou de preparacao isolada pode variar. A concentrao de potassio extracelular em pacientes com insuficiencia renal pode estar acima de 5,5 mEq/L, o que despolariza o potencial de repouso e inativa canais de sódio — efeito que nao se replica em solucao de Krebs padrao com K+ 4,7 mEq/L. Blocadores de canal de potassio como dofetilida e sotalol prolongam o APD em condicoes normais, mas em hipercaliemia o efeito pode ser atenuado porque o gradiente de K+ ja esta reduzido. O uso de celulas iPS derivadas de pacientes com Long QT syndrome tem revolucionado a avaliacao pro-arritmica, mas esses cardiomiocitos tem fenotipo fetal — o que significa que o potencial de ação é mais longo e a expressao de canais de repolarizacao rapida é menor do que no ventriculo adulto. Dados de iPS nao podem ser comparados diretamente com dados de ventriculo adulto de rato ou humano sem ajuste de idade biologica.
A informacao essencial é que potencial de ação cardiaco nao é um conceito unico. Ele varia entre tipos celulares, espécies, temperaturas e condições iônicas. Qualquer estudo que trate o potencial de ação como uma entidade padrao está cometendo um erro metodológico. A pratica no laboratorio exige controle rigoroso dessas variaveis desde o inicio, caso contrario os resultados nao sao reproduziveis fora do seu propio set-up.
