O que são lisossomos
Lisossomos são organelas revestidas por membrana que funcionam como o sistema de decomposição da célula. Eles contêm mais de 60 tipos de enzimas hidrolíticas — proteases, lipases, nucleases, glicosidases — todas operando num pH ácido em torno de 4,8 a 5,0. Sem esse ambiente ácido, essas enzimas simplesmente não funcionam. A membrana do lisossomo é glicosilada internamente, o que impede que as próprias enzimas digiram a membrana que as contém. Isso é importante porque é exatamente o tipo de coisa que dá errado em doenças lysossomais de armazenamento. A membrana lipídica dos lisossomos é rica em colesterol e em uma fosfolipídio chamado bis(monoinsacilglicerolfosfato), ou BMP. O BMP é quase exclusivo dos lisossomos e serve para dar curvatura negativa necessária à fusão com vesículas menores. Sem ele, o lisossomo simplesmente não consegue fundir eficientemente com endossomos ou autofagosomas. Isso não é trivia. Afeta diretamente a taxa de autofagia celular e, quando a expressão de BMP cai, acumula-se material não degradado dentro da organela.
o que são lisossomos na prática
Na rotina de laboratório, quando você está trabalhando com culture de células e quer medir a funcionalidade lisossomal, não adianta olhar só pra quantidade de LysoTracker. Já me deparei com um caso em que células tumorais mostravam intensidade de fluorescência LysoTracker normal, mas quando fizemos medição de pH com sonda sensível a pH, descobrimos que o pH interno estava em 6,2 ao invés de 5,0. As enzimas estavam lá, a quantidade de organela parecia normal, mas a função estava comprometida porque a bomba de prótons V-ATPase estava com rendimento reduzido por causa de estresse oxidativo. A correção foi tratar as células com N-acetilcisteína por 24 horas antes do experimento, o que restaurou o gradiente de prótons e o pH voltou ao normal. Sem essa etapa, eu teria publicado dados completamente equivocados sobre a capacidade autofágica daquelas células. O que muita gente esquece é que lisossomos não são apenas sacos de enzymes. Eles são centros de sinalização. A proteína mTORC1 é recrutada para a superfície lisossomal quando há aminoácidos suficientes, graças à ação da família de transportadores de aminoácidos SLC7A5 e do complexo Rag GTPase. Quando os aminoácidos acabam, mTORC1 sai da membrana, para de fosforilarULK1 e a autofagia é ativada. Esse é um mecanismo direto de sensing, não um efeito colateral. Se você está estudando metabolismo celular e não considera o papel do lisossomo como plataforma de sinalização, sua interpretação dos dados vai ficar incompleta.
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Doses de inibidores de catseína L, como E-64d, são usadas rotineiramente para bloquear a degradação de proteínas lisossomais durante experimentos de imunoblotting. O problema é que E-64d também inibe catpsinas B e H, e em concentrações acima de 10 µM começa a afetar a viabilidade celular por si só. Em meu trabalho, sempre uso 10 µM por 4 horas, nunca mais do que isso, e faço controle com veículo. Acima de 4 horas de tratamento, vejo aumento de lipofusina e deterioração da morfologia lisossomal, o que invalida qualquer leitura de acúmulo de substrato como sendo específico do passo que você quer bloquear. Há também a questão das doenças lysossomais de armazenamento. Gaucher, Tay-Sachs, Niemann-Pick, Fabry — todas compartilham o mesmo princípio: uma enzima hidrolítica específica está ausente ou defeituosa, e o substrato correspondente se acumula. O diagnóstico por dosagem enzimática em leucócitos ou sangue seco é padrão-ouro, mas tem limitações. Em portadoras mulheres de doença de Gaucher, a atividade da glucocerebrosidase pode estar dentro da faixa de referência simplesmente por inativação aleatória do X não ser uniforme. Nesse caso, análise molecular dos genes GBAA e GBBB é necessária. Já vi casos em que o diagnóstico bioquímico sozinho classificou erradamente uma portadora como saudável, e só o sequenciamento revelou a mutação.
O lisossomo também tem um papel crescente na imunidade. Ele funde-se com os fagossomos durante a apresentacão de antígenos via MHC classe II. Peptídeos gerados pela digestão proteolítica dentro do lisossomo são transferidos para moléculas MHC II graças à ação da região transmembrana da gp41, que regula o pH necessário para o correto encaixe do peptídeo no-binding groove. Se esse pH não for alcançado, a apresentação antigênica cai drasticamente. Isso é particularmente relevante em macrófagos e células dendríticas durante infecções intracelulares. Uma coisa que também passa batido é a relação entre lisossomos e ferroptose. O lisossomo armazena ferro na forma de ferrozina. Quando ocorre dano lisossomal, esse ferro é liberado no citosol e atua como catalisador na reação de Fenton, gerando espécies reativas de oxigênio que levam à peroxidação lipídica e morte celular. Inibidores da função lisossomal, como chloroquine em concentrações moderadas, podem na verdade proteger contra ferroptose em certos contextos, ao impedir a liberação de ferro. O efeito é dose-dependente e altamente contextual, então generalizações aqui são perigosas.
Se você está começando a trabalhar com lisossomos, não pule a etapa de validação do pH. Use sondas ratiométricas como pepTreSensor em vez de sensores de intensidade única. A leitura de intensidade é enganosa porque depende da concentração da sonda, que varia entre células e com o tempo de incubacão. Ratiometria elimina essa variável. Leve cerca de 30 minutos a mais no preparo, mas os dados ficam muito mais confiáveis.
