Como estudar o nucléolo em células vegetais na prática
Muita gente trava na hora de identificar o nucléolo numa lâmina de Onion root tip ou folha de Elodea. A questão é que ele não aparece do mesmo jeito em todas as células, e o corante que você usa muda completamente o resultado. Eu já perdi uns três dias seguidos tentando encontrar uma estrutura que claramente existia, mas só aparecia como uma mancha escura sem forma definida porque távamos usando verde de metila em vez de acetocarmim. O nucleolo da celula vegetal é basicamente uma região densa dentro do núcleo onde ocorre a montagem dos ribossomos. Diferente do que muitos materiais didáticos mostram, ele não é uma membrana delimitada. É um aglomerado de RNA ribossômico, proteínas e DNA fibrilar que se mantém unido por forças eletrostáticas e interações moleculares. Quando você olha num microscópio óptico comum, vendo entre 1000x e 1200x, ele aparece como uma corpo escuro, arredondado ou oval, variando de 1 a 3 micrômetros de diâmetro. O problema é que o núcleo inteiro já é pequeno em células vegetais, e se a célula estiver em interfase tardia ou entrando em mitose, o nucléolo simplesmente desaparece porque a transcrição de rRNA para. Parece que some, mas na verdade é só desmontar.
O que você realmente vê no microscópio
Quando eu fazia laboratório de biologia celular na graduação, a gente usava cebola (Allium cepa) porque a raiz cresce rápido e as células se dividem bastante. O protocolo que funcionava era: cortar 1 cm da ponta da raiz, fixar em álcool acético 3:1 por 24 horas, corar com acetocarmim por 5 minutos a quente, e esmagar a ponta numa lâmina coberta com lamínula. O resultado era núcleos com nucléolos bem visíveis em quase todas as células em interfase. Se você usar safranina ou azul de metileno no lugar, a coisa muda. O acetocarmim liga especificamente ao DNA e ao RNA ácido, então o nucléolo fica mais escuro que o resto do nucléoplasma. Com corantes mais genéricos, o contraste simplesmente não existe e você gasta meia hora procurando uma esfera que não se destaca do fundo.
Outro detalhe que ninguém conta: o nucléolo pode ter mais de um corpo por núcleo. Em células vegetais ativas, tipo meristemas ou células do parênquima fotossintetizante, é comum encontrar dois ou três nucléolos pequenos em vez de um grande. Isso depende da carga genética da espécie. Plantas poliplóides, como algumas variedades de trigo, podem ter nucléolos maiores simplesmente porque têm mais cópias dos genes de rRNA espalhados pelo genoma.
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A pegadinha da fixação
Aqui é onde a maioria erra. Se você fixar o tecido em formaldeído a 4% por tempo demais, o nucléolo coagula e vira uma massa irrecuperável. Ele perde a estrutura fibrilar e fica só como uma bola homogênea e escura que nada tem a ver com a realidade. Eu descobri isso da pior forma, perdendo uma semana de amostras porque o estagiário do laboratório deixou as pontas de raiz no formaldeído por 48 horas em vez das 12 recomendadas. Quando fui montar as lâminas, todos os núcleos pareciam idênticos e impossíveis de distinguir. Desfiz tudo e recomecei do zero. O fixador ideal mesmo é o álcool acético. Ele preserva melhor a arquitetura interna do nucléolo, mantendo a diferenciação entre a parte fibrilar central e a granular periférica. Claro que isso só é visível com microscopia eletrônica de transmissão, mas faz diferença na hora de interpretar o que você vê no óptico. Células fixadas corretamente têm nucléolos com bordas mais regulares e contraste melhor definido.
Quando o nucléolo não aparece e o que fazer
Se você está olhando pra uma lâmina e não encontra nenhum nucléolo visível, as opções são: as células estão em mitose avançada, o corante tá errado, ou o corte tá muito grosso. Células em mitose perdem o nucléolo na profase e só o reconstituem na telófase. Se sua amostra tiver muitas células se dividindo, naturalmente você vai achar poucos nucléolos. O segredo é procurar células grandes, com nucléoplasma mais claro e um ponto escuro bem definido perto da periferia do núcleo. Se o corte tá grosso demais, o nucléolo fica embutido em camadas de citoplasma e parede celular que atrapalham o foco. Um corte de 10 a 15 micrômetros é o ideal. Mais grosso que isso e você gasta tempo ajustando o parafuso micrométrico sem nunca conseguir nitidez real na região nuclear.
Tem ainda o caso das células envelhecidas ou em senescência. O nucléolo tende a se fragmentar ou diminuir de tamanho conforme a célula para de crescer ativamente. Em folhas maduras de Elodea, por exemplo, é muito difícil encontrar nucléolos bem formados porque a maioria das células já não está em crescimento. Se o seu objetivo é estudar a estrutura, use tecidos meristemáticos ou plântulas jovens. A taxa de células com nucléolos visíveis sobe de menos de 20% para mais de 70%.
Uma coisa que os livros não mencionam
O nucléolo não é estático. Dentro dele, há regiões de diferentes composições que se movem. A parte fibrilar central é onde o gene de rRNA está sendo transcrito ativamente, e a parte granular periférica é onde as subunidades ribossômicas estão sendo montadas. Num microscópio de fluorescência com corantes específicos pro RNA, dá pra ver essas duas zonas se separando visualmente. Sem fluorescência, você só vê uma mancha escura, mas saber que existe essa organização interna ajuda a interpretar por que o nucléolo aparece com tamanhos e formatos diferentes dependendo do estado metabólico da célula. Plantas sob estresse, seja por calor, salinidade ou deficiência nutricional, frequentemente mostram nucléolos aumentados ou com morfologia alterada. O estresse ativa a demanda por síntese proteica, e o nucléolo responde ampliando a produção de ribossomos. Esse é um indicador citológico interessante pra quem trabalha com fisiologia vegetal, mas também é um ruído se você tá tentando fazer uma descrição morfológica de rotina.
