Como fazer cromatografia em papel sem estragar a primeira tentativa
O método é simples na teoria, mas tem variáveis que confundem muita gente quando vai praticar. A cromatografia em papel depende basicamente de três coisas: o tipo de papel, a fase móvel que você escolhe e como aplica a amostra. Se um desses três estiver errado, o resultado não sai. Fica tudo misturado ou não sobe nada.
o que é a cromatografia em papel
É uma técnica de separação baseada na diferença de afinidade entre os componentes de uma mistura e duas fases: uma fixa (o papel de filtro, que retém água adsorvida) e uma móvel (um solvente ou mistura de solventes que sobe por capilaridade). Cada composto migra numa velocidade diferente, definida pelo seu coeficiente de partição entre as fases. O resultado são manchas separadas, cada uma com seu Rf característico. O Rf é a razão entre a distância percorrida pela mancha e a distância percorrida pelo frente do solvente. Variável entre 0 e 1. Compostos mais polares ficam mais retidos no papel. Compostos menos polares viajam mais. Isso vale para papel de celulose comum. Se usar papel revestido, a lógica muda completamente.
como montar na prática
Primeiro, corte tiras de papel de filtro. Tamanho comum: 2 cm de largura por 8 a 10 cm de comprimento. O papel precisa ser de qualidade cromatográfica. Papel de filtro de café funciona em situações emergenciais, mas a porosidade varia muito entre marcas, então os Rf não são reproduzíveis. Se for fazer relatório ou publicação, use papel Whatman 1 ou equivalente. Desenhe uma linha de partida com lápis a cerca de 1,5 cm da base. Lápis mesmo, caneta Mancha o resultado. A linha precisa ser reta e fina. Se for aplicar múltiplas amostras na mesma tira, marque posições a cada 1,5 cm ao longo da linha, também com lápis.
Prepare a cuba de desenvolvimento. Um béquer pequeno com tampa de relógio funciona. Ou use um frasco com tampa. O importante é que o volume interno seja pequeno e o espaço seja saturado com vapor de solvente antes de inserir o papel. Coloque uma quantidade de solvente suficiente para cobrir o fundo, mas menos que a linha de partida. Se o papel tocar o solvente diretamente antes da ascensão começar, a amostra dissolve na e o cromatograma fica destruído. Para saturar a cuba, dobre um pedaço de papel de filtro e coloque dentro, encostado na parede. Deixe fechar por 10 a 15 minutos antes de inserir a tira. Isso reduz a evaporação diferencial nas bordas e evita o efeito cup, que curva a frente do solvente para cima nos lados.
Aplique a amostra com micropipeta ou capilar de vidro. Toque levemente a superfície do papel na marcação. Deixe secar. Repita a aplicação 2 a 3 vezes no mesmo ponto para concentrar enough material sem alargir demais a mancha inicial. Cada aplicação precisa secar completamente antes da próxima. Aplicar sobre ponto úmido espalha a amostra horizontalmente e reduz a resolução. Insira a tira na cuba, feche e aguarde o desenvolvimento. O tempo varia conforme o solvente e o comprimento da tira. Geralmente 20 a 40 minutos para uma tira de 10 cm com solvente butanol:acetona:água (4:1:5, fase superior após agitação). Quando a frente do solvente chegar a cerca de 1 cm da borda superior, retire a tira e marque imediatamente a posição da frente com lápis. Secar em capela ou sob fluxo de ar.
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Visualize as manchas. Para compostos que não são coloridos, use UV a 254 nm se o papel tiver indicador fluorescente, ou spray de revelação. Vanilina ácida funciona para muitos compostos orgânicos. Dicromato de potássio em ácido sulfúrico para alcaloides. Espere secar o revelador antes de medir. Medirmancha borrada ou úmida dá Rf errado.
problema real que todo mundo encontra
Eu já perdi pelo menos meia dúzia de cromatogramas porque o solvente subia torto. O efeito cup é real e acontece principalmente quando a cuba não está saturada ou quando o papel toca as paredes. A solução que eu uso agora é simples: dobrar o papel de saturação de forma que ele fique solto, sem encostar nas laterais do recipiente, e usar cubas menores proporcionalmente ao tamanho das tiras. Se a tira de 2 cm está num béquer de 400 ml, tem ar demais e a saturação não ocorre direito. Trocar por um frasco de 125 ml resolve. Outro problema comum é sobreposição de manchas quando a amostra é. Misturas naturais, extratos de planta, hidrolisados proteicos. Nesses casos, a cromatografia em papel monodimensional simplesmente não separa tudo. Você precisa fazer desenvolvimento bidimensional: desenvolver numa direção, secar, rotacionar 90 graus e desenvolver com um solvente diferente. Dois eixos de separação. O tempo dobra, mas a resolução também.
coisas que iniciantes erram
O primeiro erro grave é confiar no Rf como identificador absoluto. Rf não é constante. Muda com a temperatura, com a umidade relativa do papel, com a idade do solvente, com a marca do papel, com a espessura da camada de água adsorvida. Um Rf que você ler na literatura pode não bater no seu cromatograma. Sempre corra um padrão concomitante na mesma tira. Isso leva 30 segundos a mais e evita conclusões erradas. O segundo erro é usar solventes puros para tudo. Sistema água:etanol não resolve quase nada que precise de separação real. Misturas ternárias ou quaternárias dão muito mais controle. Butanol:ácido acético:água (4:1:5) é um clássico para aminoácidos. Clorofórmio:metanol:água para lipídios. Éter petroleum:acetona para pigmentos. Teste combinações e anote tudo. Sem registro, você não replica.
vantagens e limitações reais da cromatografia em papel
A técnica é barata. Custa quase nada por análise se você já tem o material básico. Não precisa de equipamento caro. Consegue detectar nanogramas com reveladores adequados. É rápida para triagem inicial. Mas tem limitações sérias. Não é analítica quantitativa sem investimento adicional em densitometria. A precisão do Rf é boa para comparações relativas na mesma tira, ruim para quantificação absoluta. A resolução é baixa comparada a TLC em sílica ou HPLC. Compostos com polaridades muito próximas ficam sobrepostos. A sensibilidade é inferior a métodos cromatográficos modernos. E o papel de celulose não é estável em solventes ácidos ou básicos fortes por muito tempo. A fibra degrada, a velocidade de ascensão muda no meio do desenvolvimento, e o cromatograma termina distorcido.
Se você precisa separar compostos complexos com alta resolução ou quantificação precisa, abandone papel e vá para TLC em fase reversa ou HPLC. A cromatografia em papel serve para triagem, para ensino, para análises qualitativas rápidas onde o custo importa mais que a precisão. Não tente transformar num método analítico definitivo. Ela não aguenta esse peso. Se quiser uma tabela de Rf de referência para aminoácidos com o sistema butanol:acetona:água, posso mandar. Existe material disponível online, mas a maioria das tabelas não avisa que os valores foram obtidos a 20°C em ambiente controlado. Use como guia, não como verdade absoluta.
